肝纤维化（LF）是多种病因导致的慢性肝脏疾病，先天免疫和适应性免疫在其形成过程中发挥关键作用。大量研究已证实肝脏内CD8+T细胞具有促纤维化作用，NK细胞具有抗纤维化能力，但肝脏内B细胞的作用尚未明确。间充质干细胞（MSCs）因其具有免疫调节特性，被认为是一种很有前景的肝纤维化治疗方法。

      近期，浙江大学医学院附属第一医院曹红翠教授团队在Hepatology发表了题为“Mesenchymal stem cells alleviate mouse liver fibrosis by inhibiting pathogenic function of intrahepatic B cells”的文章，他们发现MSC的注射显著改善了肝纤维化，表现为肌成纤维细胞活化、胶原沉积和炎症表型的减少，并将这一效果归因于肝内B细胞的浸润能力、活化表型和促炎细胞因子产生的减少。他们通过单细胞RNA测序建立了一个肝内B细胞图谱，并鉴定出一种在纤维化肝脏中显著增长的幼稚B细胞亚型（B-II），其显示出成熟活化特征，并具有多种增殖和炎症基因的高表达。在B细胞缺失的小鼠（μMT）或体内抗CD20治疗的小鼠中，纤维化得到减轻。此外，通过B细胞的被动转移，μMT小鼠中重新出现纤维化，但这种纤维化可以通过MSC注射来缓解，这验证了B细胞的致病功能以及MSC在B细胞促进肝纤维化中的疗效。文章还验证了MSC可以通过外泌体调控MAPK和NF-kappa B信号通路，以抑制肝内B细胞的增殖和细胞因子的产生。

3. 单细胞RNA测序建立了肝脏浸润性B细胞的图谱

      为了深入了解CCl4诱导的LF和MSC治疗期间的肝内B细胞亚群情况，作者对来自健康、纤维化和接受MSC治疗的肝脏内B细胞进行了scRNA-seq分析（图五A），最终鉴定了具有明显转录标志的9个B细胞谱系聚类（图五B-D），并利用已知的B细胞标记基因为这9个亚组进行了注释。这些包括表达免疫球蛋白重链常数δ和免疫球蛋白M受体的Fc片段的原始B细胞（聚类1–7）、低表达Fcmr的未知B细胞（聚类8）和表达Igha和J链的浆细胞（聚类9）（图五E，F）。来自肝脏的B细胞中超过98％是原始B细胞。伪时间轨迹分析显示，沿着轨迹方向，对照组中B细胞的标志逐渐转化为CCl4组B细胞的标志，而MSC组B细胞的标志位于路径中段（图五G）。此外还观察到一部分原始B细胞（聚类2、4和7）在健康或MSC治疗的肝脏中特别稀少，但在纤维化肝脏中丰富（图五H，I），而另一部分原始B细胞（聚类1、3、5和6）表现出相反的趋势。结合每个聚类的表达谱的相关性，作者重新定义了聚类1、3、5和6为原始B-I，聚类2、4和7为原始B-II（图五F，J）。

4.MSCs调节了纤维化过程中肝内B细胞的基因表达谱，影响其激活、增殖和促炎功能

      作者分析了不同组别中B细胞的基因差异表达。正常和纤维化肝脏的B细胞之间有1557个差异表达基因（732个上调，825个下调）。纤维化肝脏的B细胞中增殖相关基因（Fos、Jun、Map2k1）及炎症相关基因（nfkb1、Cxcr4、Cxcr5、Ccr7、H2-Aa、Traf4、Tnfaip3）表达增加（图六A-C）。热图分析区分了纤维化肝脏和正常肝脏中的B细胞（图六D）。富集分析显示，上调基因在B细胞激活、受体信号通路、细胞周期及增殖调控等方面富集（图六E）。KEGG分析显示，上调的差异表达基因与B细胞受体信号通路、抗原处理和呈递、白细胞迁移等相关（图六F，G）。

      进一步分析发现，MSC治疗的肝脏中B细胞的增殖基因Jun和炎症基因Cxcr4、H2-Aa、S100a8、S100a9、Traf4、Tnfrsf13c、Traf1下调（图六H）。MSC组中B细胞下调基因富集在细胞因子反应、细胞周期调控、炎症反应、趋化作用及B细胞受体信号通路（图六I）。KEGG分析显示，下调的差异表达基因与抗原处理和呈递、内质网蛋白加工、IL-17信号通路等相关（图六J）。GSEA显示，MSC组中B细胞激活、增殖、受体信号通路、MAPK信号通路、NF-kappa B信号通路及Toll样受体信号通路基因集受到抑制（图六K）。这些结果表明，肝内B细胞在LF过程中表现出激活、增殖及促炎基因特征，而MSC治疗可以抑制这些基因的表达。

5.B细胞参与了肝纤维化的形成，并可作为MSC发挥治疗作用的靶细胞

       以上证据表明，在肝纤维化过程中，B细胞表现出激活、增殖和促炎症等表型，但其与肝纤维化严重程度之间的直接因果关系尚不明确。为确定B细胞在肝纤维化中的作用，作者进一步研究了CCl4处理8周的μMT小鼠（缺乏成熟B细胞）的肝纤维化进展情况（图七A）。结果显示，μMT小鼠的纤维化病变较野生型小鼠明显减轻（图七B-D）。然而，在B细胞缺失的肝纤维化小鼠中移植MSC并未显示进一步疗效（图七B-D），这表明MSC疗效可能依赖于肝脏内B细胞。此外，将WT小鼠的B细胞转移至μMT小鼠，加重了肝损伤和纤维化，而MSC治疗可缓解这一效应（图七E-H）。

6.MSC来源的分泌物介导了对B细胞功能的影响

       利用Transwell共培养系统，使MSCs和B细胞分离（不直接接触），MSCs对B细胞增殖的抑制作用依然存在（图八A, B）。MSC组中B细胞G0/G1期延长，S期和G2/M期缩短（图八C, D），细胞周期相关基因Ccnd2和Ccne1的mRNA水平降低（图八E），c-Myc、Cyclin D2和Cyclin E1的蛋白表达也减少（图八F）。这些结果表明，MSCs通过其分泌物调控B细胞的细胞周期分布和进程。此外，MSCs还抑制了刺激后B细胞的细胞因子产生功能，包括Tnf、Il6、Ccl2和Ccl3的mRNA水平（图八G）以及TNF-α和IL-6的分泌（图八H-J）。综上所述，MSCs通过其分泌物抑制肝内B细胞的功能

7.外泌体是MSC抑制肝内B细胞功能的关键效应机制

       MSCs分泌物包括蛋白质可溶性部分（如生长因子和细胞因子）和囊泡部分（包括微囊泡和外泌体）。为验证MSCs对肝内B细胞抑制作用中是否涉及外泌体，作者抑制了MSCs的外泌体释放。经GW4869预处理的MSCs对B细胞增殖、细胞周期进展和促炎功能的抑制效果有限（图九A-D）。接着，作者提取了MSCs来源的外泌体（ExoMSC）来验证其对B细胞功能的影响。ExoMSC处理抑制了在αIgM/αCD40或脂多糖刺激条件下的B细胞增殖（图九E-H），这可能与其调控细胞周期有关，因为大多数B细胞停留在G0/G1期（图九I-K）。同时，ExoMSC组中部分促炎基因（Tnf、Il6、Ccl2和Ccl3）的表达水平较低（图九L, M）。在纤维化肝脏中分离的激活B细胞上清液中，ExoMSC处理组产生的促炎细胞因子水平较低（图九N, O）。

       对于B细胞而言，MAPK和NF-kappa B信号传导对适当激活、增殖和促炎细胞因子的产生至关重要。如上述的测序结果所示，激活的B细胞中p-ERK、核因子kappa B抑制蛋白激酶α/β的磷酸化和核P65的信号显著增加，但在ExoMSC存在下，这些蛋白的表达减少（图十A-D）。为确切证明ExoMSC通过MAPK和NF-kappa B信号通路抑制B细胞功能，作者利用PMA激活这些信号通路，发现ExoMSC能逆转这种抑制，恢复B细胞的增殖和细胞因子产生的功能（图十F-I）。这表明ExoMSC可能主要靶向这两条信号通路中的上游分子。综上所述，外泌体是MSC抑制B细胞功能的关键因素，主要通过调控MAPK和NF-kappa B信号通路实现。