炎症性肠病(IBD)是一种肠道炎症性疾病，通常分为克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。鉴于IBD的主要病理表现局限于肠道组织，非靶向治疗药物的副作用大、疗效降低，口服给药被认为是确保药物直接递送到肠道内致病部位的最佳途径。然而，口服生物制剂，特别是RNA药物，因其对胃肠道环境易感而受到阻碍。因此，需要优化给药技术来提高口服生物药物的性能。

     近日，来自韩国首尔的Yoosoo Yang教授及其团队在《Bioactive Materials》发表了题为“Oral TNF-α siRNA delivery via milk-derived exosomes for effective treatment of inflammatory bowel disease”的研究，该研究将TNF-α siRNA装载到乳源性外泌体（Exosomes Derived From Milk ，M-Exos）中，并在小鼠模型中评估其治疗结肠炎的疗效。研究表明M-Exos作为临床应用的口服基因传递载体具有很大的前景。特别是，TNF-α siRNA负载的M-Exos可能是IBD的有效生物治疗方式。 

2.1  采用电穿孔技术将siRNA装载到M-Exos

      作者改进了传统的电穿孔方法，在电穿孔后，继续在4℃下孵育3小时加以稳定M-Exo膜（图1A），并与另一种来源于HEK293T细胞培养基（H-Exo）的外泌体进行比较。通过冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）可见，电穿孔后，M-Exos和H-Exos立即出现结构变形和表面裂纹（图1B）。在4℃孵育3小时后，M-Exos恢复到球形，H-Exos表面仍粗糙。表明M-Exo可保护siRNA免受外部刺激的影响。

2.2 M-Exo/siR通过下调TNF-α水平改善炎症，而不诱导细胞毒性

      首先，作者明确了NCM460细胞可进行siRNAs的摄取，在用荧光标记的M-Exo/siR处理NCM460细胞24小时后，测量M-Exos和siRNA荧光之间的相关性，相关系数为0.1923，表明大多数siRNA是从M-Exos释放的。M-Exos和siRNA的简单混合物（M-Exo+siR），因siRNA没有被包裹，所以不能将其递送到细胞质中（图2A）。图2B显示用siR、M-Exo或M-Exo/siR处理NCM460细胞不会诱导细胞毒性，即使siRNA的转染浓度高达320 pmol/mL，也没有观察到细胞毒性反应。

      随后，作者进一步探究，M-Exo/siR递送siRNA是否真正降低了细胞中TNF-α的mRNA和蛋白水平。图2D中可以观察到，在M-Exo/siR处理后，LPS介导的TNF-α表达量显著降低67.2%。图2E展示了相关促炎细胞因子的表达，与对照组相比，M-Exo/siR治疗组的IL 1β、IL 6和TNFα的表达被显著抑制。

2.3 动物实验证明，siRNA的成功转运可下调TNF-α水平从而改善结肠炎症状态

      作者为了探究M-Exo/siR对结肠炎的体内治疗效果，使用DSS造模后的小鼠（具有体重减轻、结肠缩短和结肠炎症等临床表现），每隔3天对小鼠进行腹腔药物注射，包括低浓度（16 nmol/kg）、高浓度（32 nmol/kg）的携带siRNA的M-Exo/siR（图3A）。结果显示，低浓度和高浓度M-Exo/siR治疗组，小鼠体重恢复情况及疾病活动指数（DAI）下降水平均优于对照组（图3B和C）。此外，低浓度和高浓度M-Exo/siR处理组的结肠长度显著长于IBD组或M-Exo组（图3D）。与对照组相比，M-Exo/siR组中血清TNF-α和mRNA的表达水平也显著降低（图3E-F）。HE染色显示，IBD组和M-Exo组，小鼠结肠炎性细胞浸润、溃疡形成和腺上皮及杯状细胞减少；而M-Exo/Sir组小鼠结肠仅有轻度的上皮损失（图3G）。

2.4 口服M-Exos中的TNF-α siRNA可有效到达小鼠肠道

       作者评估了MExos在小鼠体内的生物利用度和组织分布，主要包括心脏、肺、脾、肾、肝和胃肠道，结果清楚地显示了M-Exos在胃肠道内的强荧光信号（图4A）。口服给药8小时内，胃肠道逐渐吸收M-Exos，随后信号减弱。在H-Exos的小鼠胃肠道中显示了微弱的荧光信号。为了进一步证实siRNA被M-Exos递送到肠中，作者用Cy3标记负载siRNA的外泌体，图4B结果显示，在M-Exo/siR小鼠的胃、小肠和大肠中均有强siRNA信号。作者基于M-Exos和H-Exos的物理化学性质，从脂质组学角度进一步评估了siRNA递送的差异，发现M-Exos独特的脂质组成是保持其胃肠道稳定性的基础（图4C和D）。